Array-CGH

Comparative Genomic Hybridization Microarrays

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La tecnica di array-CGH (Comparative Genomic Hybridization) ha visto recentemente uno sviluppo massiccio, imponendosi prepotentemente come realtà diagnostica e strumento indispensabile nella genetica medica. L'evoluzione scientifica e l'ottimizzazione sperimentale ha infatti consentito di snellire e semplificare in maniera importante i protocolli analitici e di diminuire i costi, permettendo ad un numero sempre crescente di laboratori di avvicinarsi a questo tipo di tecnica.

La tecnica ArrayCGH viene utilizzata per analizzare lo sbilanciamento (duplicazione/delezione) del numero di copie di sequenze genomiche (CNV) ad una risoluzione superiore a quella possibile con le tradizionali tecniche citogenetiche.

Tale analisi non è in grado di evidenziare riarrangiamenti cromosomici bilanciati, riarrangiamenti sbilanciati delle regioni pericentromeriche, sbilanciamenti in media inferiori a quanto permesso dalla risoluzione della tecnica, non è inoltre in grado di rilevare mosaicismi al di sotto del 20-30%.

Questa nuova tecnologia è basata sull’uso di campioni di DNA test e controllo marcati con fluorocromi diversi che vengono ibridati contemporaneamente a DNA targets localizzati su un supporto di vetro. E’ una tecnica che non viene utilizzata di routine nelle procedure diagnostiche.

Nella diagnosi prenatale la tecnica ArrayCGH ha una serie di indicazioni/applicazioni in accordo con le linee guida Italiane ed Europee (E.C.A. - EUROPEAN CYTOGENETICISTS ASSOCIATION NEWSLETTER No. 29 January 2012 Pag.23; Microarray application in prenatal diagnosis: a position statement from the cytogenetics working group of the Italian Society of Human Genetics (SIGU), November 2011 Ultrasound Obstet Gynecol 2012; 39: 384–388 ) e recenti risultati scientifici: N.Engl.J.Med. 2012:367;23;2175.

Le indicazioni principali sono segnalate dalle LINEE GUIDA PER LA DIAGNOSI CITOGENETICA 2013 redatte cura del Gruppo di Lavoro in Citogenetica SIGU

Integrazione al cariotipo

Quando non è possibile ottenere la risoluzione di bandeggio raccomandata in rapporto al quesito diagnostico, in assenza di anomalie cromosomiche, è indicata la consulenza genetica per eventuale esecuzione della tecnica array-CGH/SNP o ripetizione dell’esame, in presenza di una chiara indicazione clinica.

Indicazioni in diagnosi prenatale

Ad oggi l’esame mediante array viene considerato un test di secondo livello.
E’ raccomandato l’utilizzo di una piattaforma genome-wide arricchita di sonde nelle regioni contenenti geni sensibili al dosaggio e/o geni-malattia, con risoluzione spaziale media effettiva di almeno 200 Kb e con chiamate di almeno 500 Kb nel resto del genoma (Novelli et al, 2012).
Sono considerate indicazioni all’analisi di array-CGH:
- le anomalie ecografiche isolate o multiple (inclusa la IUGR);
- i riarrangiamenti cromosomici de novo, bilanciati e sbilanciati;
- la caratterizzazione di cromosomi ESAC

Indicazioni in diagnosi postnatale

a) caratterizzazione di riarrangiamenti cromosomici identificati con il cariotipo standard.
b) categorie con deficit intellettivo e/o autismo in associazione o no con uno o più dei seguenti segni e sintomi:
- epilessia;
- ipotonia muscolare;
- anomalie fenotipiche minori, soprattutto a carico delle strutture cranio-facciali, delle mani e dei piedi;
- anomalie della crescita, sia in eccesso o in difetto, inclusa macrocefalia o microcefalia;
- una (o più) malformazione maggiore.
- “autismo non sindromico”, per la ricerca di varianti quantitative note per agire come fattore predisponente a queste condizioni.
c) Sindrome da delezione 1p36, Sindrome di Wolf-Hirschhorn, Sindrome Cri du Chat, Sindrome da delezione 22q11.
In conclusione, rappresentano indicazioni all’analisi tramite microarrays tutte le condizioni con disabilità intellettiva di qualunque entità, e/o disturbi nello spettro autistico, previo accertamento clinico/genetico di condizioni monogeniche o da sregolazione dell’imprinting genomico.(da documento GdL Genetica Clinica SIGU 2013)

La PAZIENTE che presenta le indicazioni di rischio riportate riceve le informazioni sui prelievi di Villi Coriali o Liquido amniotico per la esecuzione del CARIOTIPO e della tecnica Array-CGH

DUEinUNO: diagnosi fetale combinata ...rapida...

Cariotipo+ArrayCGH

A partire dagli anni ‘70 fino ad oggi l’analisi genetica del feto era basata sul cariotipo, di fatto un’analisi genomica a bassissima risoluzione. Questa analisi era incentrata sullo studio, al microscopio, dei cromosomi. Oggi la genetica molecolare ha reso disponibile uno strumento innovativo che scandisce e analizza gli sbilanciamenti del numero di copie delle sequenze genomiche ad una risoluzione all’incirca 100 volte superiore rispetto a quella possibile con le analisi tradizionali dei cromosomi. Queste tecniche permettono di ottenere un significativo guadagno di informazione, evitando di incorrere in errori di interpretazione basati sull’esperienza individuale, e offrono un importante supporto all’interpretazione delle anomalie cromosomiche identificate con le tecniche standard.
Al momento non è ancora possibile sostituire il cariotipo tradizionale con la tecnica degli array-CGH, in quanto alcuni limiti degli array-CGH possono essere superati solo dalle analisi cromosomiche standard. Da ciò deriva la necessità di integrare le due tecniche, utilizzandole sullo stesso campione, per ottimizzare il risultato diagnostico e ottenere uno screening avanzato del genoma del feto.
Le linee-guida alla base di questa proposta sono state pubblicate dal Gruppo di Citogenetica della Società Italiana di Genetica Umana (Ultrasound Obstet Gynecol 2012; 39: 384–388)
Al fine di fornire una corretta percezione di questa proposta è stato sviluppato il nuovo “Fetal2FastTest®” che consente di offrire una diagnosi prenatale ad elevata risoluzione, che combina al cariotipo la tecnica dell’array-CGH. Questa analisi, quando effettuata sui villi coriali, è anche rapida, in quanto permette di concludere la diagnosi mediamente in 5 giorni.

Easychip Agilent (Custom ChIP-on-chip/DNA Methylation, 8x15k) Microarray genomico di nuova generazione per il cariotipo molecolare. Aumenta la sensibilità del cariotipo convenzionale. Analizza lo sbilanciamento del numero di copie di sequenze genomiche ad una risoluzione di molto superiore a quella possibile con le tradizionali tecniche di citogenetica su metafasi. L’indagine fornisce, perciò, in tempi rapidi ed in maniera accurata informazioni relative ad una serie di riarrangiamenti non identificabili con le indagini cromosomiche tradizionali come regioni sindromiche associate a patologie note da microdelezione e micro duplicazione incluse quelle che coinvolgono le regioni subtelomeriche (cioè le estremità dei cromosomi, spesso sede di anomalie correlate con il ritardo mentale). PGT3™ è progettata per ridurre al minimo il riscontro di CNV, soprattutto di piccole dimensioni, che sono presenti nella popolazione generale come varianti benigne, cioè senza significato clinico, o di significato ignoto. In assenza di segni ecografici anomali o altre condizioni di aumentato rischio genetico del feto, questo fatto può ridurre il valore prognostico del test. Easychip Agilent (Custom ChIP-on-chip/DNA Methylation, 8x15k) (15k) è una piattaforma progettata per integrare la analisi cromosomica prenatale: 1) identifica CNV lungo il genoma con risoluzione di 3-4 Mb (4-5 volte maggiore della analisi cromosomica) riducendo dal 26% al 3% le CNV senza significato clinico o di significato ignoto. 2) Analizza le regioni subtelomeriche a una maggiore risoluzione (300-500 kb) per la ricerca di eventuali sbilanciamenti criptici 3) Analizza alla risoluzione massima di 200-250 kb le microduplicazioni o delezioni nelle regioni sindromiche associate a 43 sindromi note da microdup/del.

Analisi del cariotipo. Villi coriali, analisi cromosomica diretta: come da LLGG SIGU 2013. Tempo impiegato 4 giorni. Amniociti, analisi cromosomica IS: come da LLGG SIGU 2013. Tempo impiegato 10-12 giorni.

Il test viene offerto insieme alla consulenza genetica.